D-二聚體（D-Dimer）免疫檢測(cè)及其影響因素

D-二聚體是一種可溶性纖維蛋白降解產(chǎn)物，源自纖溶酶介導(dǎo)的交聯(lián)纖維蛋白降解。因此，D-二聚體可以被認(rèn)為是凝血和纖維蛋白溶解激活的生物標(biāo)志物，通常用于排除靜脈血栓栓塞（VTE）。D-二聚體越來越多地用于評(píng)估VTE復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，幫助確定VTE患者抗凝治療的最佳持續(xù)時(shí)間、診斷彌散性血管內(nèi)凝血以及篩查VTE風(fēng)險(xiǎn)增加的患者。

1.D-二聚體檢測(cè)方法

1.1 多克隆抗體檢測(cè)

20世紀(jì)70年代開發(fā)的第一代D-二聚體檢測(cè)法，能夠通過多克隆抗體檢測(cè)纖維蛋白原和FDP。為了避免血漿中高濃度纖維蛋白原的交叉反應(yīng)，這種免疫測(cè)定只適用于血清樣本；而且服用抗凝劑的患者會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果，在形成凝塊以及降解產(chǎn)物被吸收到凝塊中的樣本會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

1.2 單克隆抗體檢測(cè)

20世紀(jì)80年代初，隨著針對(duì)D結(jié)構(gòu)域單克隆抗體的引入，D-二聚體檢測(cè)的特異性和靈敏度顯著提高。這代免疫測(cè)定可以特異性靶向D-二聚體表位，與FDP和纖維蛋白的非交聯(lián)片段的交叉反應(yīng)性極小，因此可以使用血漿樣本。第一代方法主要以定性乳膠凝集免疫測(cè)定法為代表，使用抗體包被的乳膠微粒并需要目視檢查凝集反應(yīng)。第二代自動(dòng)化乳膠凝集免疫測(cè)定（或乳膠增強(qiáng)免疫比濁測(cè)定）通過D-二聚體的聚集率來定量D-二聚體。添加D-二聚體后，乳膠微粒凝集，從而阻止光穿過溶液。光度計(jì)測(cè)得吸光度的增加與D-二聚體濃度成正比。乳膠增強(qiáng)免疫比濁測(cè)定速度快，靈敏度與傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）相當(dāng)。

1.3 酶聯(lián)免疫熒光分析

20 世紀(jì) 90 年代中期，bioMérieux開發(fā)了一種基于ELISA的熒光終點(diǎn)檢測(cè)分析（酶聯(lián)免疫熒光分析（ELFA））。該測(cè)定顯示出與微孔板ELISA類似的靈敏度和特異性，具有自動(dòng)化優(yōu)勢(shì)，可以在更短時(shí)間（30分鐘）內(nèi)產(chǎn)生更精確的結(jié)果。Vidas^?是臨床上最有效的D-二聚體測(cè)量技術(shù)，是公認(rèn)的商業(yè)參考方法。

1.4 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析

最近，化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定法顯示出與ELISA和乳膠增強(qiáng)免疫比濁測(cè)定法相似的敏感性。磁微粒包被特異性D-二聚體單克隆抗體，用異魯米諾標(biāo)記的抗D-二聚體抗體孵育，產(chǎn)生與D-二聚體濃度成正比的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

1.5 POC D-二聚體檢測(cè)

POC D-二聚體測(cè)定能夠快速篩查患者的血栓栓塞性疾病，從而緩解急診壓力，且便于農(nóng)村地區(qū)使用。大多數(shù)POC檢測(cè)使用全血，周轉(zhuǎn)時(shí)間（TAT）短。在血凝試驗(yàn)中（如：SimplyRED^?），二價(jià)抗體對(duì)紅細(xì)胞和D-二聚體具有特異性。當(dāng)血液中存在D-二聚體時(shí)，紅細(xì)胞發(fā)生凝集并提供定性結(jié)果?；诿庖邔游觯ㄈ鏑learview Simplify^?）、熒光（如Vidas^?迷你分析儀、Triage^?、Stratus CS^?）和化學(xué)發(fā)光（如Pathfast^?）的檢測(cè)方法也存在。一些半定量檢測(cè)也在使用（如Dade Dimertest，NyoCard^?）。

表1. D-二聚體測(cè)定的特點(diǎn)

2.影響D-dimer檢測(cè)的因素

2.1 分析前變量

在止血實(shí)驗(yàn)室中大多錯(cuò)誤與分析前活動(dòng)有關(guān)，分析前錯(cuò)誤出現(xiàn)的頻率為60-70%，這遠(yuǎn)高于分析階段（10-15%）和分析后階段（15-20%）。分析前錯(cuò)誤主要集中在人工操作環(huán)節(jié)。

Salvagno等人研究了當(dāng)?shù)啬獙?shí)驗(yàn)室2年間檢測(cè)到的所有分析前錯(cuò)誤；發(fā)現(xiàn)最常見的分析前問題與實(shí)驗(yàn)室未收到樣本（49.3%）、溶血（19.5%）、凝血（14.2%）和樣本量不足有關(guān)（13.7%）。Grecu等人研究發(fā)現(xiàn)，血液學(xué)實(shí)驗(yàn)室分析前錯(cuò)誤43.2%來源于凝血樣本。Dikmen等人在為期1年的類似研究中，發(fā)現(xiàn)拒收樣本主要源于樣本凝固（35%）和體積不足（13%），且凝血測(cè)試樣本拒收率（13.3%）高于其他測(cè)試（例如生化測(cè)試為3.2%，血?dú)夥治鰹?.8%，尿液分析為9.8%）。

2.1.1 止血帶

止血帶通常用于暫時(shí)阻塞靜脈血流，幫助抽血醫(yī)生識(shí)別靜脈通路。通常建議，針頭進(jìn)入靜脈或第一根管子開始充滿時(shí)，立即取下止血帶，止血帶停留時(shí)間不超過1-2分鐘。長(zhǎng)時(shí)間使用止血帶會(huì)引起血液濃縮和形成凝塊，影響凝血檢測(cè)結(jié)果。Lippi等人觀察到，在靜脈停滯3分鐘后采集的樣本中，D-二聚體值（Mini Vidas^?免疫分析儀）增加13.4%。靜息1分鐘后平均增加7.9%。

2.1.2 抗凝劑

臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所（CLSI）和世界衛(wèi)生組織（WHO）建議在絕大多數(shù)止血測(cè)試中使用含有3.2%（105-109 mmol/L）緩沖檸檬酸鈉抗凝劑的采集管，不建議使用肝素化/EDTA等會(huì)顯著干擾凝塊測(cè)定（例如 PT、APTT、FV、FVIII）的抗凝劑。血液與抗凝劑的推薦比例為9/1，異?？鼓壤ǔ?huì)延長(zhǎng)凝血時(shí)間（PT、APTT 和 TT），導(dǎo)致D-二聚體和纖維蛋白原估值偏低。

一些商業(yè)化D-二聚體檢測(cè)（包括POC檢測(cè)）允許使用檸檬酸鹽、肝素化或EDTA血漿（Pathfast^?、Tina-quant^?（羅氏，瑞士）、AQT-90^?（Radiometer，丹麥）、Simplify^?（Agen Inc，澳大利亞）），而其他廠家則建議僅使用檸檬酸鹽抗凝血液（例如 Vidas^?、BCS^?、STA-Liatest^?（Diagnostica Stago，Asnières，法國）、Immulite^?（西門子，美國）。

2.1.3 溶血

體外溶血是臨床實(shí)驗(yàn)室分析前問題最常見的原因之一。患者自身（例如溶血性貧血、代謝紊亂、傳染源）、抽血（例如針頭尺寸、止血帶時(shí)間、外傷性抽血、未混合或劇烈混合血管）、樣品運(yùn)輸（例如PTS、時(shí)間、急或重癥監(jiān)護(hù)病房）、處理（例如離心前延遲、樣本重旋、運(yùn)輸時(shí)間/溫度）和儲(chǔ)存（例如溫度和持續(xù)時(shí)間）都可能造成溶血。CLSI指南H21-A5（血漿凝血試驗(yàn)和分子止血試驗(yàn)血液標(biāo)本的收集、運(yùn)輸和處理）建議不要使用可見溶血的樣品，因?yàn)閾p傷細(xì)胞釋放的促凝因子可能造成實(shí)驗(yàn)偏差。臨床實(shí)驗(yàn)室的大部分溶血標(biāo)本（±95%）僅為輕度溶血（無細(xì)胞血紅蛋白0.3-0.6 g/L）。因此，當(dāng)游離血紅蛋白濃度低于非干擾限度（即< 3g /L）時(shí)，D-二聚體值可能仍然是可靠的。

2.1.4 穩(wěn)定性與儲(chǔ)存

雖然D-二聚體主要用于急診和快速測(cè)量；但當(dāng)樣品儲(chǔ)存在中心實(shí)驗(yàn)室以及在研究環(huán)境中使用時(shí)，需要穩(wěn)定性信息。多項(xiàng)研究表明D-二聚體可能會(huì)穩(wěn)定較長(zhǎng)時(shí)間，目前建議測(cè)試前樣品在室溫（15-25℃）下保存不超過4小時(shí)。在許多不同的D-二聚體免疫測(cè)定中，D-二聚體在室溫（RT）或2-8℃下可穩(wěn)定至少24小時(shí)（在血漿/全血中）。此外，有研究表明，凍融程序不會(huì)顯著影響D-二聚體檢測(cè)結(jié)果。

2.2 分析變量

2.2.1 方法間差異

D-二聚體檢測(cè)目前的主要問題就是免疫測(cè)定法之間的高度差異性。這種差異與以下幾個(gè)因素有關(guān)：1）D-二聚體包含交聯(lián)纖維蛋白降解產(chǎn)物的廣泛混合物，2）使用不同的單克隆抗體，3）缺乏國際認(rèn)證的內(nèi)控或校準(zhǔn)品，以及4）單位和臨床界值的使用差異。

2014年，美國病理學(xué)家學(xué)會(huì)（CAP）凝血資源委員會(huì)在一項(xiàng)涉及3800個(gè)實(shí)驗(yàn)室的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，方法間變異系數(shù)（CV）高達(dá)42%。根據(jù)UKNEQAS的四份報(bào)告（2017年4月、2017年7月、2017年9月和2018年1月），非FEU和FEU單位的方法間CV（排除異常值后）分別為33.4%、38.2%、41.8%、30.9%和18%、19.3%、17.7%和19%；這四項(xiàng)調(diào)查涉及736至752個(gè)實(shí)驗(yàn)室。

2.2.2 校準(zhǔn)品

校準(zhǔn)材料主要通過纖維蛋白凝塊的可控裂解獲得。因此，制造商必須確保裂解是可重復(fù)的，以獲得相同大小的降解產(chǎn)物，因?yàn)闄z測(cè)的靈敏度可能會(huì)根據(jù)高分子量纖維蛋白原（HMWF）或低分子量纖維蛋白原（LMWF）的相對(duì)量而變化。D-二聚體測(cè)定可用純化的纖維蛋白片段D-二聚體等同物，或根據(jù)用于制備校準(zhǔn)品的纖維蛋白原量進(jìn)行校準(zhǔn)。

2.3 分析后變量

2.3.1 計(jì)量單位

D-二聚體單位根據(jù)所用校準(zhǔn)品的類型而變化，目前臨床實(shí)驗(yàn)室使用兩種單位：D-二聚體單位（DDU）和纖維蛋白原當(dāng)量單位（FEU）。FEU將D-二聚體的質(zhì)量與纖維蛋白原的質(zhì)量進(jìn)行比較，校準(zhǔn)品是通過纖溶酶降解純化的纖維蛋白原（存在因子XIII的情況下凝固）制備的。DDU是確定的D-二聚體質(zhì)量，校準(zhǔn)品由純化的D-二聚體組成。最近的研究表明，大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室使用FEU計(jì)量，主要測(cè)量單位是mg/L，其次是ng/mL。在可用的測(cè)量單位中，μg/L（或ng/mL）最接近國際系統(tǒng)（SI）的單位。需要注意的是使用不同的單位（FEU或DDU，以及不同的測(cè)量單位）可能會(huì)造成混亂，并導(dǎo)致患者的分類錯(cuò)誤或誤診。

2.3.2 年齡cut off值

D-二聚體值通常隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，大部分老年患者的D-二聚體水平高于500μg/L FEU的傳統(tǒng)cut off值。現(xiàn)在普遍建議使用年齡調(diào)整cut off值（即[年齡調(diào)整cut off值，μg/L FEU] = [年齡（歲）×10]）來報(bào)告D-二聚體檢測(cè)結(jié)果。使用特定的年齡cut off值能夠大幅提高陽性預(yù)測(cè)值（PPV）。

2.3.3 周轉(zhuǎn)時(shí)間

周轉(zhuǎn)時(shí)間（TAT）是D-二聚體報(bào)告的一個(gè)關(guān)鍵方面，因?yàn)镈-dimer檢測(cè)主要用于緊急臨床情況。意大利共識(shí)文件推薦總體TAT<1小時(shí)，這似乎適用于管理絕大多數(shù)緊急測(cè)試請(qǐng)求。建議使用線性范圍寬（即高達(dá)5000μg/L），且不進(jìn)行額外稀釋的測(cè)定法，以及使用更快且經(jīng)過驗(yàn)證的離心過程、氣動(dòng)管道系統(tǒng)（PTS）或可靠的POC分析儀，以減少TAT。

3. 關(guān)于D-二聚體檢測(cè)的建議

由于不同的D -二聚體免疫檢測(cè)（即形式、抗體）的異質(zhì)性和缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，在實(shí)施靜脈血栓栓塞管理策略之前，應(yīng)評(píng)估當(dāng)?shù)胤椒ǖ姆治龊团R床性能。用于排除VTE的cut off值需要在當(dāng)?shù)卮_認(rèn)，根據(jù)英國血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)指南的建議，使用至少200名受試者?？梢允褂弥圃焐探ㄗh的cut off值，前提是已在其他地方進(jìn)行了可靠的驗(yàn)證研究，并且未發(fā)現(xiàn)顯著的批間差異。許多檢測(cè)方法（例如 Vidas、AxSYM、STA-Liatest）的cut off值已在前瞻性研究中得到臨床驗(yàn)證。在選擇制造商時(shí)，應(yīng)考慮此因素。另外，制造商應(yīng)及時(shí)了解有關(guān)其免疫測(cè)定法使用的最新文獻(xiàn)，在需要時(shí)更新cut off值。

D-二聚體檢測(cè)的是具有不同分子量的交聯(lián)纖維蛋白降解產(chǎn)物的混合物，不應(yīng)與纖維蛋白原或FDP反應(yīng)。最好也不要與各種酶介導(dǎo)的蛋白水解釋放的纖維蛋白和纖維蛋白原片段反應(yīng)。

參考文獻(xiàn)

Favresse J, Lippi G, Roy PM, et al. D-dimer: Preanalytical, analytical, postanalytical variables, and clinical applications[J]. Crit Rev Clin Lab Sci, 2018, 55(8): 548-577.

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